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Development of molecular markers for varietal identification of Brassica juncea on the basis of the polymorphic sequence of ITS regions and MITE families

Kiwoung Yang,Go-eun Yi,Arif Hasan Khan Robin,Namhee Jeong,Yonghyuk Lee,Jong-In Park,Hoy-Taek Kim,M. Chung,I. Nou

Published 2016 in Korean Journal of Horticultural Science & Technology

ABSTRACT

Brassica juncea (2n = 4x = 36, AABB genome, 1,068 Mb) is a U’s triangle species and an amphidiploid derivative of B. rapa and B. nigra. Fifteen varieties were used to study the ITS (internal transcribed spacer) regions of ribosomal DNA and MITEs (miniature inverted-repeat transposable elements) with a view of developing specific molecular markers. ITSs and MITEs are an excellent resource for developing DNA markers for genomics and evolutionary studies because most of them are stably inherited and present in high copy numbers. The ITS (ITS1 and ITS2) sequence was compared with the consensus sequence of B. rapa and B. nigra. Variation in ITS1 created two separate groups among 15 varieties, with 10 varieties in one group and 5 in the other. Phylogenetic analysis revealed two major clusters for those 10 and 5 varieties. Among the 160 different MITE primers used to evaluate the selected 15 varieties of B. juncea, 70 were related to the Stowaway, 79 to the Tourist, 6 to the hAT, and 5 to the Mutator super-families of MITEs. Of 160 markers examined, 32 were found to be polymorphic when fifteen different varieties of B. juncea were evaluated. The variety ‘Blackgat’ was different from the other mustard varieties with respect to both phenotype and genotype. The diversity of 47 additional accessions could be verified using eight selected molecular markers derived from MITE family sequences. The polymorphic markers identified in this study can be used for varietal classification, variety protection, and other breeding purposes. Additional key words: B. juncea, molecular marker, ITS of rDNA, InDel marker, phylogenic tree Received: November 24, 2015 Revised: December 28, 2015 Accepted: March 23, 2016 Copyrightc2016 Korean Society for Horticultural Science. 본 연구는 농림축산식품부, 해양수산부, 농촌진흥청, 산 림청 Golden Seed 프로젝트 사업(원예종자사업단, 과제번호: 213003-04-4-SB110)에 의해 이루어진 것임. Korean J. Hortic. Sci. Technol. 34(2):305-313, 2016 http://dx.doi.org/10.12972/kjhst.20160031 pISSN : 1226-8763 eISSN : 2465-8588 갓 (Brassica juncea) 품종구분을 위한 ITS 영역 및 MITE Family 정보를 이용한 분자표지 개발 Korean Journal of Horticultural Science & Technology 306 서 언 배추과(Brassicaceae) 식물은 338 속(genera), 약 3,709 종(species)으로 이루어져 있으며, 세계적으로 경제적 가치가 매우 높은 작 물에 속한다(Al-Shehbaz et al., 2006; Bailey et al., 2006). 그 중 갓(Brassica juncea)은 배추(Brassica rapa; 2n = 2x = 20, AA genome, 529Mb)와 흑겨자(Brassica nigra; 2n = 2x = 16, BB genome, 632Mb)의 복이배체(amphidiploid)로 2n = 4x = 36, 전체 유전체는 약 1,068Mb를 가지고 있는 식물이다(Johnston et al., 2005). 갓은 유전체 및 유전자에 대한 연구가 세계적으로 미비하기에 많은 연구 를 필요로 한다. 갓의 유연관계 및 유전적 다양성에 대한 분석은 거의 이루어지지 않았으며, ribosomal DNA의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역, RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 및 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisms)를 이용한 소수의 연구만이 진행되었다(Fu et al., 2006; Qi et al., 2007; Song et al., 1990; Song et al., 1988). 갓의 유연관계 및 유전적 다양성에 대한 분석은 다양한 육종재료 확보 및 품종 판별에 활용할 수 있을 것이다. 분자표지는 목표형질과 가까이 연관되거나 목표형질을 결정하는 유전자의 DNA염기서열 변이에 기초해서 개발되기 때문 에 환경영향을 받지 않으므로 시간과 장소의 구애를 받지 않고 기존의 육종방법보다 빠르고, 정확한 정보를 얻을 수 있다(Kim et al., 2015; Kim et al., 2014). 분자표지는 유전적 다양성 연구, 종 및 품종 판별, 유전자 지도 작성 및 주요 형질 선발 등 넓은 분 야에서 이용하고 있다. 최근에는 다양한 분자표지가 개발되고 있는데, SSR(Simple Sequence Repeat), SNP(Single Nucleotide Polymorphism), InDel(Insertion and Deletion) 등의 분자표지가 범용으로 활용되고 있다. 특히, InDel 표지는 아가로스 겔에서 쉽게 구분할 수 있으며 재현성이 매우 높아 많은 연구자들이 선호하는 표지이다. 종 및 품종에서 유연관계를 알아보기 위해 주로 ITS 영역 염기서열의 다형성을 많이 이용한다. 최근에 약용식물의 유연관계 를 확인하기 위해 7점의 후보 DNA 바코드에 대해 연구하였다(Chen et al., 2010). Chen et al.(2010)은 7점의 DNA 바코드 (psbAtrnH, matK, rbcL, rpoC1, ycf5, ITS1 및 ITS2) 중에 ITS2 영역에서 753속, 4800종, 약 6600개체에서 확인하였고, 92.7%의 성공적인 동 정률을 나타냈다. ITS2 영역은 약용식물들과 밀접하게 관련된 종들의 동정을 위한 표준 DNA 바코드로서 이용 할 수 있음을 입 증하였다. Qi et al.(2007)은 중국 갓 16 품종에서 ITS 영역을 활용하여 분자 계통도를 분석하였다. ITS1과 ITS2 영역을 분리하여 확인한 결과 ITS1 영역에서는 흑겨자 서열과 유사한 4 품종, 배추 서열과 유사한 12 품종을 확인하였다. ITS2 영역에서는 흑겨 자 서열과 유사한 3 품종, 배추 서열과 유사한 13 품종을 확인하였다. ITS 영역으로 확인한 결과 갓은 흑겨자보다 배추에 더 근 접한 품종이 많이 나타났다. 이러한 결론은 엽록체 DNA, 미토콘드리아 DNA, RFLP의 결과 갓이 흑겨자보다 배추 염기서열과 유사하다는 것과 일치한다(Palmer and Herbon, 1988; Song et al., 1990; Warwick and Black, 1991; Yang et al., 2002). MITE (miniature inverted-repeat transposable element)는 동물, 식물, 박테리아 등에 아주 빈번하게 존재하며, 크기는 800bp보다 작다(Casacuberta et al., 2003; Turcotte et al., 2001). 또한, 비 독립형 엘리먼트(non-autonomous elements)의 말단 역 반복(Terminal Inverted Repeats: TIR)으로 sequence 길이의 범위가 10-15bp의 차이를 나타내는 경우도 있다(Zhang et al., 2000). MITE는 유전자 부위(intron, exon, and UTR; untranslated regions, promoters)와 매우 근접하게 조합되어 있기 때문에 유전자의 구조, 발현, 기능을 변형할 수 있다. 배추에서 MITE는 triplicated 유전자의 구조적 변형 또는 발현양의 변화를 가져오 기도 한다(Sampath et al., 2013; Yang et al., 2006). MITE는 안정적으로 유전되고, 많은 copy로 존재하기 때문에 유전체학과 진화 연구를 위한 DNA 분자표지로 매우 적합하다(Amundsen et al., 2011). 실제로 MITE는 벼 9.98%, Medicago 8.21%, 수박 5.53%, 배추 4.05%, 토마토 3.44%, 옥수수 1.96%, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 0.71% 이상으로 식물 유전체에 주요 부분 을 차지하고 있다(Chen et al., 2014). Chen et al.(2014)은 in silico tools를 활용하여 배추에서 174 MITE families를 공개하였 다. 총 45,821 MITEs를 확인하였고, 이는 배추 유전체의 11Mb (4.08%)를 차지한다. 또한, Sampath et al.(2014)은 배추, 양배 추 그리고 애기장대의 MITE를 비교 분석하여 20 families로 구분하였다. 20 families는 4 BraSto (Stowaway families as Brassica Stowaway), 13 BraTo (Tourist families as Brassica Tourist), 2 BraHAT (hAT families as Brassica hAT), 1 BraMu (Mutator family as Brassica Mutator)로 구분하였다. 총 290점의 분자표지로 163점의 배추관련, 127점의 양배추관련 분자표 갓 (Brassica juncea) 품종구분을 위한 ITS 영역 및 MITE Family 정보를 이용한 분자표지 개발 Korean Journal of Horticultural Science & Technology 307 지를 개발하였다. 본 연구에서는 갓 15 품종의 ribosomal DNA ITS 영역 염기서열을 확인하여 유연관계를 확인하였으며, 기존에 발표된 MITE 분자표지로 갓의 품종판별 활용가능성을 알아보았다(Sampath et al., 2014; White et al., 1990). MITE 분자표지는 쉽고 유용하게 판별 할 수 있는 InDel 표지 위주로 선발하였으며, 선발한 MITE를 활용하여 다양한 유전자원에서 구분할 수 있는지 검증하였다. 재료 및 방법 식물재료 및 DNA 추출 갓 재료는 시중에서 판매하는 품종과 국내 갓 생산지역 및 일본에서 수집하였다. 갓 15 품종은 얼청갓(Eolcheonggat), 남도갓(Namdoogat), 청갓(Cunggat), 남양갓(Namyanggat), 동강갓(Dongganggat), 동원적갓(Dongwonredgat), 청송갓 (Cheongsonggat), 봉래갓(Bongraegat), 흑갓(Heukgat; Accession number, IT200214), J23, 농우적갓(Nongwooredgat), 팔강 갓(Palgangat), J15, J16, J17로 관련 분자표지를 확인하였다(Fig. 1). J23, J15, J16, J17은 일본에서 수집한 품종이다. 또한, 여 수시 농업기술센터에서 갓 유전자원 47점을 분양 받아 분자표지의 다형성을 확인하였다. 재배는 순천대학교 생명산업과학대 학 원예학과 비닐하우스에서 재배하였고, DNA 추출은 발아 후 4주 된 유엽을 사용하였다. 각 식물 시료는 TissueLyser(QIAGEN, Netherlands)를 이용하여 분쇄하였으며, DNA는 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Cat. No. 69104)을 사용하여 추출하였다. ITS 및 MITE 분자표지 선발 갓의 유연관계를 알아보기 위해 이전에 보고된 ribosomal DNA의 ITS 관련 분자표지를 이용하였다. PCR 증폭으로 확인하 기 위해 이용한 분자표지는 BJ_ITS-F: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’와 BJ_ITS-R: 5’-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’이다(Qi et al., 2007; White et al., 1990). 갓의 품종구분을 위한 MITE 분자표지는 Sampath et al.(2014)에 의해 보고 된 290점의 분자표지 중 배추와 양배추 각각 다형성을 많이 보이는 80점을 선발하여 총 160점의 분자표지를 이용하였다 (Supplementary Table 1). Fig. 1. The phenotypic appearance of the 15 selected B. juncea varieties and/or accessions. (A) Eolcheonggat, (B) Namdoogat, (C) Cunggat, (D) Namyanggat, (E) Dongganggat, (F) Dongwonredgat, (G) Cheongsonggat, (H) Bongraegat, (I) Blackgat, (J) J23, (K) Nongwooredgat, (L) Palganggat, (M) J15, (N) J16, (O) J17. J-accessions were collected from Japan. Alphabet A-I, K and L are varieties and J and M-O are accessions. A

PUBLICATION RECORD

  • Publication year

    2016

  • Venue

    Korean Journal of Horticultural Science & Technology

  • Publication date

    Unknown publication date

  • Fields of study

    Biology, Physics

  • Identifiers
    DOI 10.12972/KJHST.20160031
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